Рис. 4.1
Морфологию вирусов изучают с помощью электронной микроскопии, так как их размеры малы (18-400 нм) и сравнимы с толщиной оболочки бактерий. Форма вирионов может быть различной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), нитевидной (филовирусы), в виде сперматозоида (многие бактериофаги). Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы (табл. 4.1).
Просто устроенные вирусы (без оболочки)
Пример просто устроенных вирусов - вирус гепатита А и папилломавирус с икосаэдрическим типом симметрии (рис. 4.1 и 4.2). Нуклеиновая кислота вирусов связана с белковой оболочкой - капсидом, состоящим из капсомеров.
Рис. 4.2. Схема строения папилломавируса (содержит двунитевую кольцевую ДНК)
Сложно устроенные вирусы (с оболочкой)
У сложно устроенных вирусов (например, у вирусов герпеса, гриппа, флавивирусов) от липопротеиновой оболочки отходят гликопротеиновые шипы, например, гемагглютинины, участвующие в реакциях гемагглютинации и гемадсорбции. Вирус герпеса и флавивирус имеют икосаэдрический тип симметрии, а вирус гриппа - спиральный тип симметрии нуклеокапсида.
|
Таблица 4.1. Просто устроенные (без оболочки) и сложно устроенные (с оболочкой) вирусы |
|
|
Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, называемой капсидом (от лат. capsa - футляр). Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц - капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид. |
Тип симметрии |
|
Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены липопротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболочка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые шипы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный М-белок. |
|
Рис. 4.3.
Рис. 4.4.
Рис. 4.5
Рис. 4.6.
Репродукция вирусов
Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой:
- продуктивный тип, при котором образуются новые вирионы, по-разному выходящие из клетки: при ее лизисе, т. е. «взрывным» механизмом (безоболочечные вирусы); путем «почкования» через мембраны клетки (оболочечные вирусы), в результате экзоцитоза;
- абортивный тип, характеризующийся прерыванием инфекционного процесса в клетке, поэтому новые вирионы не образуются;
- интегративный тип, или вирогения, заключающийся в интеграции, т. е. встраивании вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместном сосуществовании (совместная репликация).
Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой - репродукция вируса проходит несколько стадий: 1) адсорбция вирионов на клетке; 2) проникновение вируса в клетку;
3) «раздевание» и высвобождение вирусного генома (депротеинизация вируса); 4) синтез вирусных компонентов;
5) формирование вирусов; 6) выход вирионов из клетки.
Механизм репродукции вирусов
Механизм репродукции отличается у вирусов, имеющих: 1) двунитевую ДНК; 2) однонитевую ДНК; 3) плюс-однонитевую РНК; 4) минус-однонитевую РНК; 5) двунитевую РНК;
6) идентичные плюс-нитевые РНК (ретровирусы).
Двунитевые ДНК-вирусы - вирусы, содержащие двунитевую ДНК в линейной (например, герпесвирусы, аденовирусы и поксвирусы) или в кольцевой форме (как папилломавирусы).
Репликация двунитевых вирусных ДНК проходит обычным полуконсервативным механизмом: после расплетения нитей ДНК к ним комплементарно достраиваются новые нити. У всех вирусов, кроме поксвирусов, транскрипция вирусного генома происходит в ядре.
Уникальна по механизму репродукция гепаднавирусов (вируса гепатита В).
Геном гепаднавирусов (рис. 4.7) представлен двунитевой кольцевой ДНК, одна нить которой короче (неполная плюснить) другой нити. После проникновения в клетку сердцевины вируса (1) неполная нить ДНК-генома достраивается; формируется полная двунитевая кольцевая ДНК (2) и созревающий геном (3) попадает в ядро клетки. Здесь клеточная ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует разные иРНК (для синтеза вирусных белков) и РНК-прегеном (4) - матрицу для репликации генома вируса. Далее иРНК перемещаются в цитоплазму и транслируются с образованием белков вируса. Белки сердцевины вируса собираются вокруг прегенома. Под действием РНК-зависимой ДНК-полимеразы вируса на матрице прегенома синтезируется минус-нить ДНК (5), на которой образуется плюс-нить ДНК (6). Оболочка вириона формируется на HBs-содержащих мембранах эндоплазматической сети или аппарата Гольджи (7). Вирион выходит из клетки экзоцитозом.
Рис. 4.7.
Однонитевые ДНК-вирусы. Представителями однонитевых ДНК-вирусов являются парвовирусы (рис. 4.8).
Поглощенный вирус поставляет геном в ядро клетки. Парвовирусы используют клеточные ДНК-полимеразы для создания двунитевого вирусного генома, так называемой репликативной формы последнего. При этом на исходной вирусной ДНК (плюс-нить) комплементарно синтезируется минус-нить ДНК, служащая матрицей в синтезе плюс-нити ДНК для новых поколений вирусов. Параллельно синтезируется иРНК, происходит трансляция вирусных белков, которые возвращаются в ядро, где собираются вирионы.
Плюс-однонитевые РНК-вирусы. Это большая группа вирусов (пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы и др.), у которых геномная плюс-нить РНК выполняет функцию иРНК (рис. 4.9).
Вирус (1), после эндоцитоза, освобождает в цитоплазме (2) геномную плюс-РНК, которая как иРНК связывается с рибосомами (3): транслируется полипротеин (4), который расщепляется на 4 структурных белка (NSP 1-4), включая РНК-зависимую РНК-полимеразу. Эта полимераза транскрибирует геномную плюс-РНК в минус-нить РНК (матрицу), на которой (5) синтезируются копии РНК двух размеров: полная плюс-нить 49S геномной РНК; неполная нить 26S иРНК, кодирующая С-белок капсида (6) и гликопротеины оболочки Е1-3. Гликопротеины синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума, затем включаются в мембрану и гликозилируются. Дополнительно гликозилируясь в аппарате Гольджи (7), они встраиваются в плазмалемму. С-белок образует с геномной РНК нуклеокапсид который взаимодействует с модифицированной плазмалеммой (8). Вирусы выходят из клетки почкованием (9).
Минус-однонитевые РНК-вирусы (рабдовирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы) имеют в своем составе РНК-зависимую РНК-полимеразу.
Проникшая в клетку геномная минус-нить РНК парамиксовируса (рис. 4.10) трансформируется вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой в неполные и полные плюс-нити РНК. Неполные копии выполняют роль иРНК для синтеза вирусных белков. Полные копии являются промежуточной матрицей для синтеза минус-нитей геномной РНК потомства.
Рис.4.8.
Рис. 4.9.
Рис. 4.10
Вирус связывается гликопротеинами оболочки с поверхностью клетки и сливается с плазмалеммой (1). С геномной минус-нити РНК вируса транскрибируются неполные плюс-нити РНК, являющиеся иРНК (2) для отдельных белков и полная минус-нить РНК - матрица для синтеза геномной минус-РНК вируса (3). Нуклеокапсид связывается с матриксным белком и гликопротеин-модифицированной плазмалеммой. Выход вирионов - почкованием (4).
Двунитевые РНК-вирусы
. Механизм репродукции этих вирусов (реовирусов и ротавирусов) сходен с репродукцией минус-однонитевых РНК-вирусов.
Особенность репродукции состоит в том, что образовавшиеся в процессе транскрипции плюс-нити функционируют не только как иРНК, но и участвуют в репликации: они являются матрицами для синтеза минус нитей РНК. Последние в комплексе с плюс-нитями РНК образуют геномные двунитевые РНК вирионов. Репликация вирусных нуклеиновых кислот этих вирусов происходит в цитоплазме клеток.
Ретровирусы (плюс-нитевые диплоидные РНК-вирусы, обратнотранскрибирующиеся), например вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).
ВИЧ связывается гликопротеином gp120 (1) с рецептором CD 4 Т-хелперов и других клеток. После слияния оболочки
Рис. 4.11.
ЦПД - видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов.
ВИЧ с плазмалеммой клетки в цитоплазме освобождаются геномная РНК и обратная транскриптаза вируса, которая на матрице геномной РНК синтезирует комплементарную ми- нус-нить ДНК (линейная кДНК). С последней (2) копируется плюс-нить с образованием двойной нити кольцевой кДНК (3), которая интегрирует с хромосомной ДНК клетки. С рекомбинантной ДНК-провируса (4) синтезируются геномная РНК и иРНК, которые обеспечивают синтез компонентов и сборку вирионов. Вирионы выходят их клетки почкованием (5): сердцевина вируса «одевается» в модифицированную плазмалемму клетки.
Культивирование и индикация вирусов
Вирусы культивируют в организме лабораторных животных, в развивающихся куриных эмбрионах и культурах клеток (тканей). Индикацию вирусов проводят на основе следующих феноменов: цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов, образования внутриклеточных включений, образования бляшек, реакции гемагглютинации, гемадсорбции или «цветной» реакции.
Рис. 4.13
Включения - скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения - тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы - внутриядерные включения.
Рис. 4.14.
«Бляшки», или «негативные» колонии - ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной «бляшки». «Негативные» колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод «бляшек» используют для дифференциации вирусов, а также для определения их концентрации.
Рис. 4.12.
Рис.4.15.
Реакция гемагглютинации основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов за счет вирусных гликопротеиновых шипов - гемагглютининов.
Способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты.
Рис. 4.16.
«Цветная» реакция оценивается по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде культивирования. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению pH среды и, соответственно, цвета индикатора. При продукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный цвет.
Оглавление темы "Типы микроорганизмов. Вирусы. Вирион.":1. Микроорганизмы. Типы микроорганизмов. Классификация микроорганизмов. Прионы.
2. Вирусы. Вирион. Морфология вирусов. Размеры вирусов. Нуклеиновые кислоты вирусов.
3. Капсид вируса. Функции капсида вирусов. Капсомеры. Нуклеокапсид вирусов. Спиральная симметрия нуклеокапсида. Кубическая симметрия капсида.
4. Суперкапсид вируса. Одетые вирусы. Голые вирусы. Матричные белки (М-белки) вирусов. Репродукция вирусов.
5. Взаимодействие вируса с клеткой. Характер взаимодействия вирус-клетка. Продуктивное взаимодействие. Вирогения. Интерференция вирусов.
6. Типы инфицирования клеток вирусами. Репродуктивный цикл вирусов. Основные этапы репродукции вирусов. Адсорбция вириона к клетке.
7. Проникновение вируса в клетку. Виропексис. Раздевание вируса. Теневая фаза (фаза эклипса) репродукции вирусов. Образование вирусных частиц.
8. Транскрипция вируса в клетке. Трансляция вирусов.
9. Репликация вируса в клетке. Сборка вирусов. Высвобождение дочерних вирионов из клетки.
Вирусы. Вирион. Морфология вирусов. Размеры вирусов. Нуклеиновые кислоты вирусов.
Внеклеточная форма - вирион - включает в себя все составные элементы (капсид, нуклеиновую кислоту, структурные белки, ферменты и др.). Внутриклеточная форма - вирус - может быть представлена лишь одной молекулой нуклеиновой кислоты, так как, попадая в клетку, вирион распадается на составные элементы.
Морфология вирусов. Размеры вирусов.
Нуклеиновые кислоты вирусов
Вирусы содержат только один тип нуклеиновой кислоты, ДИК или РНК, но не оба типа одновременно. Например, вирусы оспы, простого герпеса, Эпстайна-Барр - ДНК-содержащие, а тогавирусы, пикорнавирусы - РНК-содержащие. Геном вирусной частицы гаплоидный. Наиболее простой вирусный геном кодирует 3-4 белка, наиболее сложный - более 50 полипептидов. Нуклеиновые кислоты представлены однонитевыми молекулами РНК (исключая реовиру-сы, у которых геном образован двумя нитями РНК) или двухнитевыми молекулами ДНК (исключая парвовирусы, у которых геном образован одной нитью ДНК). У вируса гепатита В нити двухнитевой молекулы ДНК неодинаковы по длине.
Вирусные ДНК образуют циркулярные, ковалентно-сцёпленные суперспирализованные (например, у паповавирусов) или линейные двухнитевые структуры (например, у герпес- и аденовирусов). Их молекулярная масса в 10-100 раз меньше массы бактериальных ДНК. Транскрипция вирусной ДНК (синтез мРНК) осуществляется в ядре заражённой вирусом клетки. В вирусной ДНК на концах молекулы имеются прямые или инвертированные (развёрнутые на 180") повторяющиеся нуклеотидные последовательности. Их наличие обеспечивает способность молекулы ДНК замыкаться в кольцо. Эти последовательности, присутствующие в одно- и двух-нитевых молекулах ДНК, - своеобразные маркёры вирусной ДНК.
Рис. 2-1. Размеры и морфология основных возбудителей вирусных инфекций человека
.
Вирусные РНК представлены одно- или двухнитевыми молекулами. Однонитевые молекулы могут быть сегментированными - от 2 сегментов у ареновирусов до 11 - у ротавирусов. Наличие сегментов ведёт к увеличению кодирующей ёмкости генома. Вирусные РНК подразделяют на следующие группы: плюс-нити РНК (+РНК), минус-нити РНК (-РНК). У различных вирусов геном могут образовывать нити +РНК либо -РНК, а также двойные нити, одна из которых -РНК, другая (комплементарная ей) - +РНК.
Плюс-нити РНК представлены одиночными цепочками, имеющими характерные окончания («шапочки») для распознавания рибосом. К этой группе относят РНК, способные непосредственно транслировать генетическую информацию на рибосомах заражённой вирусом клетки, то есть выполнять функции мРНК. Плюс-нити выполняют следующие функции: служат мРНК для синтеза структурных белков, матрицей для репликации РНК, упаковываются в капсид с образованием дочерней популяции. Минус-нити РНК не способны транслировать генетическую информацию непосредственно на рибосомах, то есть они не могут функционировать как мРНК. Однако такие РНК служат матрицей для синтеза мРНК.
Инфекционность нуклеиновых кислот вирусов
Многие вирусные нуклеиновые кислоты инфекционны сами по себе, так как содержат всю генетическую информацию, необходимую для синтеза новых вирусных частиц. Эта информация реализуется после проникновения вириона в чувствительную клетку. Инфекционные свойства проявляют нуклеиновые кислоты большинства +РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Двухнитевые РНК и большинство -РНК не проявляют инфекционных свойств.
Вирусные заболевания возникли в глубокой древности, однако вирусология как наука начала развиваться в конце XIX века.
В 1892 г. русский ученый-ботаник Д. И. Ивановский, изучая мозаичную болезнь листьев табака, установил, что заболевание это вызывается мельчайшими микроорганизмами, которые проходят через мелкопористые бактериальные фильтры. Эти микроорганизмы получили название фильтрующихся вирусов (от лат. virus - яд). В дальнейшем было показано, что имеются и другие микроорганизмы, проходящие через бактериальные фильтры, поэтому фильтрующиеся вирусы стали называть просто вирусами.
Большой вклад в изучение вирусов внесли советские вирусологи: М. А. Морозов, Н. Ф. Гамалея, Л. А. Зильбер, М. П. Чумаков, А. А. Смородинцев, В. М. Жданов и др.
Вирусы - это неклеточная форма существования живой материи. Они очень малы. По образному выражению В. М. Жданова "величину их по отношению к величине средних бактерий можно сравнить с величиной мыши по отношению к слону". Увидеть вирусы стало возможным только после изобретения электронного микроскопа.
В настоящее время для изучения вирусов используют много методов: химические, физические, молекулярно-биологические, иммунобиологические и генетические.
Все вирусы подразделяются на поражающие человека, животных, насекомых, бактерии и растения.
У вирусов наблюдается большое разнообразие форм и биологических свойств, однако все они имеют общие черты строения. Зрелые частицы вирусов называют вирионами.
В отличие от других микроорганизмов, содержащих одновременно ДНК и РНК, вирион содержит только одну из нуклеиновых кислот - либо ДНК, либо РНК.
Нуклеиновая кислота вирусов может быть однонитчатой и двунитчатой. Почти все вирусы, содержащие РНК, имеют в своем геноме однонитчатую РНК, а содержащие ДНК - двунитчатую ДНК. В соответствии с двумя типами генетического вещества вирусы подразделяют на РНК- и ДНК-содержащие. К ДНК-содержащим относятся 5 семейств, РНК-содержащим - 10 семейств.
* (Здесь приведены данные, касающиеся только некоторых из патогенных для человека вирусов. )
Структура вириона . В центре вириона находится нуклеиновая кислота, которая окружена капсидом (от греч. kanca - ящик). Капсид состоит из белковых субъединиц, называемых капсомерами. Зрелый вирус по химической структуре является нуклеокапсидом. Количество капсомер и способ их укладки (рис. 52) строго постоянны для каждого вида вируса. Например, вирус полиомиелита содержит 32 капсомера, а аденовирус - 252 капсомера. Капсомеры могут быть уложены в виде многогранника с равномерными симметричными гранями - кубоидальная форма (например, аденовирус). Укладка в виде спиралей (сферическая) характерна для вирусов гриппа. Может быть тип симметрии, при котором нуклеиновая кислота имеет вид пружины, вокруг которой уложены капсомеры, в этом случае вирус имеет палочковидную форму - вирус, вызывающий болезнь листьев табака.
Сложный тип симметрии имеет фаг: головка - кубоидальной, а отросток - палочковидной формы (сперматозоидная форма) (см. рис. 21, 22).
Таким образом, в зависимости от способа укладки вирусы подразделяют на кубоидальную, сферическую, палочковидную и сперматозоидную формы.
Некоторые вирусы, обладающие более сложной структурой, имеют оболочку, которая называется пеплос. Она образуется при выходе вируса из клетки хозяина. Вирусный капсид при этом обволакивается внутренней поверхностью цитоплазматической мембраны клетки хозяина и образуется один или несколько слоев оболочки суперкапсид. Такую оболочку имеют только некоторые вирусы, например вирусы бешенства, герпеса, энцефалита. Эта оболочка содержит фосфолипиды, разрушающиеся под воздействием эфира. Таким образом, воздействуя эфиром, можно отличить вирус, имеющий пеплос, от вируса с "голым капсидом".
У некоторых вирусов из внешнего липидного слоя оболочки выступают капсомеры в виде шипов (эти шипы тупые). Такие вирусы называются пепломерами (например, вирус гриппа, см. рис. 52).
Нуклеиновая кислота вируса является носителем наследственных свойств, а капсид и внешняя оболочка несут защитные функции, как бы оберегая нуклеиновую кислоту. Кроме того, они способствуют проникновению вируса в клетку.
Размеры вирусов . Измеряются вирусы в нанометрах. Величина их колеблется в широком диапазоне от 15-20 до 350-400 нм.
Методы измерения вирусов : 1) фильтрование через бактериальные фильтры с известной величиной пор; 2) ультрацентрифугирование - крупные вирусы осаждаются быстрее; 3) фотографирование вирусов в электронном микроскопе.
Химический состав вирусов . Количество и содержание ДНК и РНК вирусов неодинаковы. У ДНК молекулярная масса колеблется от 1·10 6 до 1,6·10 8 , а у РНК - от 2·10 6 до 9,0·10 6 .
Белки у вирионов обнаружены в незначительном числе, они состоят из 16-20 аминокислот. Кроме капсидных белков, имеются еще внутренние белки, связанные с нуклеиновой кислотой. Белки обусловливают антигенные свойства вирусов, а также в силу плотной укладки полипептидных цепей ограждают вирус от действия ферментов клетки хозяина.
Липиды и углеводы обнаружены во внешней оболочке сложных вирионов. Источником липидов и углеводов является оболочка клетки хозяина. Полисахариды, входящие в состав некоторых вирусов, обусловливают способность их вызывать агглютинацию эритроцитов.
Ферменты вирусов . Вирусы не имеют собственного метаболизма, поэтому они не нуждаются в ферментах обмена веществ. Однако у некоторых вирусов выявлено наличие ферментов, способствующих проникновению их в клетку хозяина. Например, у вируса гриппа А обнаружена нейраминидаза, отщепляющая нейраминовую кислоту, содержащуюся в оболочках животных клеток (эритроцитов и др.). У фагов - лизоцим, разрушающий клеточную оболочку, фосфатаза и др.
Выявление вирусных антигенов . Вирусные антигены в инфицированных клетках хозяина можно обнаружить с помощью метода иммунофлюоресценции. Препараты, содержащие клетки, инфицированные вирусами, обрабатывают специфическими иммунными люминесцирующими сыворотками. При просмотре в люминесцентном микроскопе в местах скопления вирусных частиц наблюдается характерное свечение. Вид вируса определяют по соответствию специфической люминесцирующей сыворотки, вызвавшей свечение.
Внедрение вируса в клетку, взаимодействие его с клеткой хозяина и репродукция (размножение) слагаются из ряда последовательных стадий.
Стадия 1. Начинается с процесса адсорбции за счет рецепторов вириона и клетки. У сложных вирионов рецепторы располагаются на поверхности оболочки в виде шиловидных выростов (вирус гриппа), у простых вирионов - на поверхности капсида.
Стадия 2. Проникновение вируса в клетку хозяина протекает по-разному у разных вирусов. Например, некоторые фаги протыкают оболочку своим отростком и впрыскивают нуклеиновую кислоту в клетку хозяина (см. главу 8). Другие вирусы попадают в клетку путем втягивания вирусной частицы с помощью вакуоли, т. е. на месте внедрения в оболочке клетки образуется углубление, затем края ее смыкаются и вирус оказывается в клетке. Такое втягивание называется виропексис.
Стадия 3. "Раздевание вируса" (дезинтеграция). Для своего воспроизведения вирусная нуклеиновая кислота освобождается от защищающих ее белковых покровов (оболочки и капсида). Процесс раздевания может начаться во время адсорбции, а может произойти тогда, когда вирус находится уже внутри клетки.
Стадия 4. На этой стадии происходит репликация (воспроизведение) нуклеиновых кислот и синтез вирусных белков. Эта стадия происходит при участии ДНК или РНК клетки хозяина.
Стадия 5. Сборка вириона. Этот процесс обеспечивается самосборкой белковых частиц вокруг вирусной нуклеиновой кислоты. Синтез белка может начаться непосредственно после синтеза вирусной нуклеиновой кислоты либо после интервала в несколько минут или несколько часов. У одних вирусов самосборка происходит в цитоплазме. У других в ядре клетки хозяина. Образование внешней оболочки (пеплоса) всегда происходит в цитоплазме.
Стадия 6. Выход вириона из клетки хозяина происходит путем просачивания вируса через оболочку клетки либо через отверстие, образовавшееся в клетке хозяина (в этом случае клетка хозяина погибает).
Типы взаимодействия вируса и клетки . Первый тип - продуктивная инфекция - характеризуется образованием новых вирионов в клетке хозяина.
Второй тип - абортивная инфекция заключается в том, что обрывается репликация нуклеиновой кислоты.
Третий тип - характеризуется встраиванием вирусной нуклеиновой кислоты в ДНК клетки хозяина; возникает форма сосуществования вируса и клетки хозяина (вирогения). В этом случае обеспечивается синхронность репликации вирусной и клеточной ДНК. У фагов это называется лизогения.
Микроскопическое исследование . При отдельных вирусных инфекциях в цитоплазме или ядрах клеток организма хозяина наблюдаются специфические внутриклеточные тельца - включения, имеющие диагностическое значение (тельца Бабеша - Негри при бешенстве, тельца Гварниери при оспе и др.). Размеры вирусных частиц и телец-включений удается искусственно увеличить специальными методами обработки препаратов с протравой и импрегнацией (например, метод серебрения по Морозову) и наблюдать при иммерсионной микроскопии. Более мелкие вирионы, лежащие за пределами видимости оптического микроскопа, обнаруживаются только при электронной микроскопии. Существуют разные точки зрения в отношении внутриклеточных включений. Одни авторы считают, что они представляют собой скопление вирусов. Другие считают, что они возникают в результате реакции клетки на внедрение вирусов.
Генетика вирусов . Модификация (ненаследуемые изменения) у вирусов обусловливается особенностями клетки хозяина, в которой происходит репродукция вируса. Модифицированные вирусы приобретают способность заражать клетки, аналогичные тем, в которых они модифицировались. У разных вирусов модификация по-разному проявляется. Например, у фагов изменяется форма "негативных пятен" (фаговых колоний).
Мутация - у вирусов возникает под влиянием тех же мутагенов, которые вызывают мутацию у бактерий (физические и химические факторы). Возникает мутация во время репликации нуклеиновых кислот. Мутации затрагивают различные свойства вирусов, например чувствительность к температуре и др.
Генетическая рекомбинация у вирусов может возникнуть в результате одновременного заражения клетки хозяина двумя вирусами, при этом может произойти обмен отдельными генами между двумя вирусами и образуются рекомбинанты, содержащие гены двух родителей.
Генетическая реактивация генов иногда происходит при скрещивании инактивированного вируса с полноценным, что приводит к спасению инактивированного вируса.
Спонтанная и направленная генетика вирусов имеет большое значение в развитии инфекционного процесса.
Устойчивость к факторам окружающей среды . Большинство вирусов инактивируется при действии высоких температур. Однако имеются исключения, например вирус гепатита термоустойчив.
К низким температурам вирусы не чувствительны, ультрафиолетовые солнечные лучи оказывают инактивирующее действие на вирусы. Рассеянный солнечный свет действует на них менее активно. Вирусы устойчивы к глицерину, что дает возможность длительно сохранять их в глицерине. Они устойчивы к антибиотикам (при культивировании вирусов исследуемый материал обрабатывают антибиотиками для подавления бактериальной флоры).
Кислоты, щелочи, дезинфицирующие вещества инактивируют вирусы. Однако некоторые вирусы, инактивированные формалином, сохраняют иммуногенные свойства, что позволяет использовать формалин для получения вакцин (вакцина против бешенства).
Восприимчивость животных . Круг восприимчивых животных для некоторых вирусов очень широк, например к вирусам бешенства чувствительны многие животные. Некоторые вирусы поражают только один вид животного, например вирус чумы собак поражает только собак. Имеются вирусы, к которым животные не чувствительны - например, вирус кори и т. д.
Органотропность вирусов . Вирусы обладают способностью поражать определенные органы, ткани и системы. Например, вирус бешенства поражает нервную систему. Вирус оспы обладает дермотропностью и т. д.
Выделение вирусов в окружающую среду . Из больного организма вирусы могут выделяться с калом, например вирус полиомиелита и другие энтеровирусы. Вирус бешенства выделяется со слюной, вирус гриппа - с отделяемым слизистой носоглотки и т. д.
Основные пути передачи вирусов . Воздушно-капельный (грипп, оспа), пищевой (полиомиелит, гепатит А), контактно-бытовой (бешенство), трансмиссивный (энцефалит).
Противовирусный иммунитет . Организм человека обладает врожденной устойчивостью к некоторым вирусам. Например, человек не чувствителен к вирусу чумы собак. Животные не чувствительны к вирусу кори. В этих случаях противовирусный иммунитет основан на отсутствии клеток, способных поддерживать репродукцию вирусов.
Противовирусный иммунитет обусловливается как клеточными, так и гуморальными факторами защиты, неспецифическими и специфическими. Неспецифические факторы. Мощным ингибитором репродукции вирусов является белковое вещество - интерферон. В здоровом организме он содержится в незначительном количестве, а вирусы способствуют продукции интерферона и количество его значительно увеличивается. Он неспецифичен, так как блокирует репродукцию разных вирусов. Однако он обладает тканевой специфичностью, т. е. клетки разных тканей образуют неодинаковый интерферон. Считают, что механизм действия его заключается в том, что он препятствует синтезу белка в клетке хозяина и этим прекращает репродукцию вируса.
К специфическим факторам противовирусного иммунитета относятся вируснейтрализующие антитела, гемагглютинирующие и преципитирующие.
Методы культивирования вирусов . Вирусы размножаются только в жизнеспособных клетках. Их культивируют: в куриных эмбрионах (рис. 53), культурах ткани человека и различных животных, в организме чувствительных животных, восприимчивых членистоногих.
В первый период развития вирусологии основным методом изучения вирусов являлось искусственное заражение животных, но этот метод сложный, и кроме этого животные ко многим вирусам оказались невосприимчивы.
Большое значение в развитии вирусологии имело введение методов культивирования вирусов в куриных эмбрионах и в культуре клеток тканей человека и животных.
Заражение куриных эмбрионов . Для репродукции вирусов используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста, инкубированные в термостате при 37° С. Необходимым условием для правильного развития зародыша является соблюдение определенной влажности воздуха, которую можно создать, поместив в термостат сосуд с водой.
Пригодность куриного эмбриона для заражения определяется по наличию движений эмбриона и развитой сети кровеносных сосудов на хорион-аллантоисной оболочке при просвечивании с помощью овоскопа.
Культивирование вирусов в куриных эмбрионах проводится в разных местах эмбриона, который заражают (см. рис. 53):
1) на хорион-аллантоисную оболочку,
2) в аллантоисную полость;
3) в амниотическую полость;
4) в желточный мешок.
Заражение куриных эмбрионов проводят в боксе с использованием стерильных инструментов. Перед заражением куриные эмбрионы двукратно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом.
Заражение на хорион-аллантоисную оболочку. После дезинфекции яйца осторожно срезают кусочек скорлупы с тупого конца, снимают подскорлупную оболочку - при этом обнаруживается хорион-аллантоисная оболочка. Инфекционный материал в количестве 0,1-0,2 мл при помощи шприца или пастеровской пипетки наносят на хорион-аллантоисную оболочку. После заражения отверстие закрывают колпачком и просвет между ним и куриным эмбрионом заливают парафином.
На другой стороне яйца простым карандашом пишут название инфекционного материала и дату заражения.
Заражение в амниотическую полость. Яйцо овоскопируют и на боковой стороне выбирают участок, где хорион-аллантоис лишен крупных кровеносных сосудов. Этот участок отмечают карандашом. Яйца укладывают на подставку в горизонтальном положении, дезинфицируют и специальным стерильным копьем прокалывают отверстие в скорлупе на глубину 213 мм, через которое вводят на это же расстояние иглу с инфекционным материалом непосредственно в амниотическую полость. Для того чтобы вводимая жидкость не вытекала обратно, предварительно делают прокол над воздушным мешком, после чего оба отверстия заливают парафином.
Заражение в аллантоисную полость. Заражение проводят в затемненном боксе. Отмечают воздушное пространство, скорлупу над воздушным пространством дезинфицируют и через отверстие в скорлупе вводят по направлению к эмбриону иглу шприца с материалом. Если игла попала в аллантоисную полость, то наблюдается смещение тени эмбриона. После заражения отверстие заливают парафином.
Заражение в желточный мешок. Скорлупу дезинфицируют. Яйцо помещают на подставку тупым концом вправо так, чтобы желточный мешок был обращен вверх. Над воздушной камерой в центре прокалывают отверстие. Через отверстие в скорлупе в горизонтальном направлении на глубину 2-3 мм вводят иглу шприца, которая попадает в желточный мешок. Материал вводят в объеме 0,2-0,3 мл. После введения материала отверстие парафинируют.
Температурный режим и длительность инкубации зависят от биологических свойств введенного вируса.
Инфицированные яйца ежедневно проверяют - овоскопируют для проверки жизнеспособности эмбриона. Если эмбрионы погибают в первые сутки, то причиной этого обычно бывает травма при заражении. Такие яйца выводят из опыта.
При необходимости раздельно исследовать каждую составную часть эмбриона материал собирают в определенном порядке: отсасывают аллантоисную жидкость, затем амниотическую жидкость, разрезают хорион-аллантоисную оболочку, отделяют амниотическую оболочку, эмбрион, желточный мешок и только после этого извлекают хорион-аллантоисную оболочку, отделив ее от внутренней поверхности скорлупы. Наличие вируса в зараженном эмбрионе определяют по характерным изменениям хорион-аллантоисной оболочки зараженного куриного эмбриона.
Вирусы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, выявляют с помощью РСК.
Для выявления вируса в аллантоисной или амниотических жидкостях зараженных эмбрионов ставят РГА (гемагглютинация вызывается аллантоисной или амниотическими жидкостями или взвесью, приготовленной из хорион-аллантоисной оболочки).
Культивирование вирусов в культуре клеток . Для накопления вирусов в чувстсительных клеточных культурах используются ткани человека и различных животных. Наибольшее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток.
Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоских сосудах-матрацах. Клеточная суспензия в жидкой питательной среде при температуре 37° С позволяет получить "in vitro" слой клеток с определенной гистологической структурой. Присутствие вирусов в культурах тканей обнаруживают по изменению (дегенерации) клеток. Тип вирусов определяют путем нейтрализации действия вирусов при добавлении к вируссодержащему материалу соответствующих типоспецифических сывороток.
Эти методы позволяют быстрее учитывать результаты исследования и являются более экономичными. В тех случаях, когда вирусы не вызывают цитопатического действия (дегенерации) и не развиваются в куриных эмбрионах, пользуются методами заражения животных (см. главу 11).
Для культивирования вирусов используют перевиваемые клетки, которые чаще получают из клеток злокачественных опухолей.
Однослойные культуры получают из эмбрионов человека, курицы, животных.
Преимущество однослойных культур клеток - простота методики и легкость учета.
Способность клеток к размножению вне организма связана со степенью дифференциации ткани. Менее дифференцированные ткани обладают большей способностью к пролиферации (соединительная, эпителиальная ткань).
Сущность методов при приготовлении первичных культур ткани заключается в разрушении межклеточной ткани и разобщении клеток для последующего получения монослоя.
Разобщение клеток проводится путем воздействия на ткань протеолитических ферментов, чаще всего трипсина. Раствор трипсина способствует разъединению клеток при сохранении у них способности к размножению. Для выращивания культуры клеток необходима питательная среда. Состав среды сложный, он включает целый ряд ингредиентов: аминокислоты, глюкозу, витамины, минеральные соли, коферменты и т. д. Получение культуры ткани проводят в строго асептических условиях. В среду добавляются антибиотики (500 ЕД пенициллина и 250 ЕД стрептомицина в 1 мл) для подавления роста бактериальной флоры.
Подготовленную ткань заливают 0,25% раствором подогретого трипсина и инкубируют в термостате при 37° С. Во время инкубации ткань периодически помешивают путем вращения колбы. Трипсинизированные клетки центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 5 мин.
Трипсинизацию и центрифугирование проводят очень осторожно, чтобы не травмировать клетки. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок клеток помещают в небольшой объем питательной среды. Для получения однородной массы взвесь клеток фильтруют через один слой марли в воронке (стерильной). Взвесь клеток проверяют на стерильность путем посева по 0,1 мл, в 2 пробирки с сахарным бульоном.
Успех культивирования клеток зависит от посевной Дозы, поэтому после трипсинизации производят подсчет клеток в камере Горяева. После подсчета взвесь клеток разводят питательной средой из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалось 500000-1000000 клеток и разливают по пробиркам и матрацам. Пробирки с культурой ткани инкубируют в термостате в наклонном положении.
Посеянные культуры ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера их роста. Нормальные пролиферирующие клетки светлые и растут однослойным пластом. Если клетки темные, зернистые и не пролиферируют, что может быть результатом загрязнения (плохая обработка посуды или загрязнение ингредиентов), то такие культуры изымают из опыта.
Смена питательной среды через 2-3 дня после посева улучшает интенсивность пролиферации.
Нормальные, хорошо пролиферирующие клетки заражают исследуемым материалом.
Перевиваемые культуры преимущественно получают из злокачественных опухолей. Штамм Hela - культура клеток рака шейки матки женщины по имени Helena (получен в 1950 г.); штамм Нер-2 выделен от больного раком гортани. Рост этих клеток поддерживается в лабораториях путем последовательных пассажей. Особенность их заключается в том, что они размножаются в течение длительного срока. В настоящее время эти клетки прошли уже тысячи генераций. В процессе пассажей они теряют некоторые морфологические и биохимические свойства - подвергаются мутации. Однако остаются вполне пригодными для культивирования в них вирусов. Культурой этих клеток пользуются лаборатории всего мира.
Размножение вируса в культуре клеток происходит в различные сроки в зависимости от свойств вируса и вида клеток.
О наличии вируса судят по цитопатическому действию. В микроскопе наблюдается дегенерация клеток. Время цитопатического действия и его характер зависят от дозы и свойств вируса.
У некоторых вирусов цитопатическое действие обнаруживается через несколько дней (вирус оспы), у других - через 1-2 нед (вирус гепатита и др.).
В настоящее время известны уже сотни вирусов, поражающих человека. Борьба с вирусными инфекциями осуществляется разными методами. Наиболее эффективна иммунизация. Таким способом ликвидирована оспа, сокращена заболеваемость полиомиелитом. Важное значение в борьбе с вирусными инфекциями имеют общественная профилактика - уничтожение бродячих собак (борьба с бешенством), личная профилактика и т. д.
Однако эти меры не могут обеспечить ликвидацию всех вирусных заболеваний. Ученые настойчиво ищут пути, при помощи которых можно было бы поразить вирус, не повредив клетку, в которой он находится.
Поэтому закономерно, что в программе КПСС вирусология названа одной из ведущих отраслей естественнонаучных знаний, которая должна получить преимущественное развитие в ближайшие годы.
Основные методы исследования вирусов . 1. Реакция гемагглютинации, реакция задержки гемагглютинации, реакция непрямой гемагглютинации. Реакция связывания комплемента.
2. Реакция нейтрализации вирусов в культуре тканей.
3. Метод иммунофлюоресценции.
4. Гистологический метод - выявление включений (телец Бабеша - Негри - при бешенстве; телец Пашена - при оспе и др.).
5. Биологический метод.
Вирусы – микроорганизмы, составляющие царство Vira.
Отличительные признаки:
2) не имеют собственных белоксинтезирующих и энергетических систем;
3) не имеют клеточной организации;
4) обладают дизъюнктивным (разобщенным) способом репродукции (синтез белков и нуклеиновых кислот происходит в разных местах и в разное время);
6) вирусы проходят через бактериальные фильтры.
Вирусы могут существовать в двух формах: внеклеточной (вириона) и внутриклеточной (вируса).
По форме вирионы могут быть:
1) округлыми;
2) палочковидными;
3) в виде правильных многоугольников;
4) нитевидными и др.
Размеры их колеблются от 15–18 до 300–400 нм.
В центре вириона – вирусная нуклеиновая кислота, покрытая белковой оболочкой – капсидом, который имеет строго упорядоченную структуру. Капсидная оболочка построена из капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсидная оболочка составляют нуклеокапсид.
Нуклеокапсид сложноорганизованных вирионов покрыт внешней оболочкой – суперкапсидом, которая может включать в себя множество функционально различных липидных, белковых, углеводных структур.
Строение ДНК– и РНК-вирусов принципиально не отличается от НК других микроорганизмов. У некоторых вирусов в ДНК встречается урацил.
ДНК может быть:
1) двухцепочечной;
2) одноцепочечной;
3) кольцевой;
4) двухцепочечной, но с одной более короткой цепью;
5) двухцепочечной, но с одной непрерывной, а с другой фрагментированной цепями.
РНК может быть:
1) однонитевой;
2) линейной двухнитевой;
3) линейной фрагментированной;
4) кольцевой;
Вирусные белки подразделяют на:
1) геномные – нуклеопротеиды. Обеспечивают репликацию вирусных нуклеиновых кислот и процессы репродукции вируса. Это ферменты, за счет которых происходит увеличение количества копий материнской молекулы, или белки, с помощью которых на матрице нуклеиновой кислоты синтезируются молекулы, обеспечивающие реализацию генетической информации;
2) белки капсидной оболочки – простые белки, обладающие способностью к самосборке. Они складываются в геометрически правильные структуры, в которых различают несколько типов симметрии: спиральный, кубический (образуют правильные многоугольники, число граней строго постоянно) или смешанный;
3) белки суперкапсидной оболочки – это сложные белки, разнообразные по функции. За счет них происходит взаимодействие вирусов с чувствительной клеткой. Выполняют защитную и рецепторную функции.
Среди белков суперкапсидной оболочки выделяют:
а) якорные белки (одним концом они располагаются на поверхности, а другим уходят в глубину; обеспечивают контакт вириона с клеткой);
б) ферменты (могут разрушать мембраны);
в) гемагглютинины (вызывают гемагглютинацию);
г) элементы клетки хозяина.
2. Взаимодействие вирусов с клеткой хозяина
Взаимодействие идет в единой биологической системе на генетическом уровне.
Существует четыре типа взаимодействия:
1) продуктивная вирусная инфекция (взаимодействие, в результате которого происходит репродукция вируса, а клетки погибают);
2) абортивная вирусная инфекция (взаимодействие, при котором репродукции вируса не происходит, а клетка восстанавливает нарушенную функцию);
3) латентная вирусная инфекция (идет репродукция вируса, а клетка сохраняет свою функциональную активность);
4) вирус-индуцированная трансформация (взаимодействие, при котором клетка, инфицированная вирусом, приобретает новые, ранее не присущие ей свойства).
После адсорбции вирионы проникают внутрь путем эндоцитоза (виропексиса) или в результате слияния вирусной и клеточной мембран. Образующиеся вакуоли, содержащие целые вирионы или их внутренние компоненты, попадают в лизосомы, в которых осуществляется депротеинизация, т. е. «раздевание» вируса, в результате чего вирусные белки разрушаются. Освобожденные от белков нуклеиновые кислоты вирусов проникают по клеточным каналам в ядро клетки или остаются в цитоплазме.
Нуклеиновые кислоты вирусов реализуют генетическую программу по созданию вирусного потомства и определяют наследственные свойства вирусов. С помощью специальных ферментов (полимераз) снимаются копии с родительской нуклеиновой кислоты (происходит репликация), а также синтезируются информационные РНК, которые соединяются с рибосомами и осуществляют синтез дочерних вирусных белков (трансляцию).
После того как в зараженной клетке накопится достаточное количество компонентов вируса, начинается сборка вирионов потомства. Процесс этот происходит обычно вблизи клеточных мембран, которые иногда принимают в нем непосредственное участие. В составе вновь образованных вирионов часто обнаруживаются вещества, характерные для клетки, в которой размножается вирус. В таких случаях заключительный этап формирования вирионов представляет собой обволакивание их слоем клеточной мембраны.
Последним этапом взаимодействия вирусов с клетками является выход или освобождение из клетки дочерних вирусных частиц. Простые вирусы, лишенные суперкапсида, вызывают деструкцию клетки и попадают в межклеточное пространство. Другие вирусы, имеющие липопротеидную оболочку, выходят из клетки путем почкования. При этом клетка длительное время сохраняет жизнеспособность. В отдельных случаях вирусы накапливаются в цитоплазме или ядре зараженных клеток, образуя кристаллоподобные скопления – тельца включений.
3. Культивирование вирусов
Основные методы культивирования вирусов:
1) биологический – заражение лабораторных животных. При заражении вирусом животное заболевает. Если болезнь не развивается, то патологические изменения можно обнаружить при вскрытии. У животных наблюдаются иммунологические сдвиги. Однако далеко не все вирусы можно культивировать в организме животных;
2) культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы выращивают в инкубаторе 7-10 дней, а затем используют для культивирования. В этой модели все типы зачатков тканей подвержены заражению. Но не все вирусы могут размножаться и развиваться в куриных эмбрионах.
В результате заражения могут происходить и появляться:
1) гибель эмбриона;
2) дефекты развития: на поверхности оболочек появляются образования – бляшки, представляющие собой скопления погибших клеток, содержащих вирионы;
3) накопление вирусов в аллантоисной жидкости (обнаруживают путем титрования);
4) размножение в культуре ткани (это основной метод культивирования вирусов).
Различают следующие типы культур тканей:
1) перевиваемые – культуры опухолевых клеток; обладают большой митотической активностью;
2) первично трипсинизированные – подвергшиеся первичной обработке трипсином; эта обработка нарушает межклеточные связи, в результате чего выделяются отдельные клетки. Источником являются любые органы и ткани, чаще всего – эмбриональные (обладают высокой митотической активностью).
Для поддержания клеток культуры ткани используют специальные среды. Это жидкие питательные среды сложного состава, содержащие аминокислоты, углеводы, факторы роста, источники белка, антибиотики и индикаторы для оценки развития клеток культуры ткани.
О репродукции вирусов в культуре ткани судят по их цитопатическому действию, которое носит разный характер в зависимости от вида вируса.
Основные проявления цитопатического действия вирусов:
1) размножение вируса может сопровождаться гибелью клеток или морфологическими изменениями в них;
2) некоторые вирусы вызывают слияние клеток и образование многоядерного синцития;
3) клетки могут расти, но делиться, в результате чего образуются гигантские клетки;
4) в клетках появляются включения (ядерные, цитоплазматические, смешанные). Включения могут окрашиваться в розовый цвет (эозинофильные включения) или в голубой (базофильные включения);
5) если в культуре ткани размножаются вирусы, имеющие гемагглютинины, то в процессе размножения клетка приобретает способность адсорбировать эритроциты (гемадсорбция).
4. Особенности противовирусного иммунитета
Противовирусный иммунитет начинается со стадии презентации вирусного антигена Т-хелперами.
Сильными антигенпрезентирующими свойствами при вирусных инфекциях обладают дендритные клетки, а при простом герпесе и ретровирусных инфекциях – клетки Лангерганса.
Иммунитет направлен на нейтрализацию и удаление из организма вируса, его антигенов и зараженных вирусом клеток. Антитела, образующиеся при вирусных инфекциях, действуют непосредственно на вирус или на клетки, инфицированные им. В этой связи выделяют две основные формы участия антител в развитии противовирусного иммунитета:
1) нейтрализацию вируса антителами; это препятствует рецепции вируса клеткой и проникновению его внутрь. Опсонизация вируса с помощью антител способствует его фагоцитозу;
2) иммунный лизис инфицированных вирусом клеток с участием антител. При действии антител на антигены, экспрессированные на поверхности инфицированной клетки, к этому комплексу присоединяется комплемент с последующей его активацией, что и обуславливает индукцию комплементзависимой цитотоксичности и гибель инфицированной вирусом клетки.
Недостаточная концентрация антител может усиливать репродукцию вируса. Иногда антитела могут защищать вирус от действия протеолитических ферментов клетки, что при сохранении жизнеспособности вируса приводит к усилению его репликации.
Вируснейтрализующие антитела действуют непосредственно на вирус лишь в том случае, когда он, разрушив одну клетку, распространяется на другую.
Когда вирусы переходят из клетки в клетку по цитоплазматическим мостикам, не контактируя с циркулирующими антителами, то основную роль в становлении иммунитета играют клеточные механизмы, связанные прежде всего с действием специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-эффекторов и макрофагов. Цитотоксические Т-лимфоциты непосредственно контактируют с клеткой-мишенью, повышая ее проницаемость и вызывая осмотическое набухание, разрыв мембраны и выход содержимого в окружающую среду.
Механизм цитотоксического эффекта связан с активацией мембранных ферментных систем в зоне прилипания клеток, образованием цитоплазматических мостиков между клетками и действием лимфотоксина. Специфические Т-киллеры появляются уже через 1–3 дня после заражения организма вирусом, их активность достигает максимума через неделю, а затем медленно понижается.
Одним из факторов противовирусного иммунитета является интерферон. Он образуется в местах размножения вируса и вызывает специфическое торможение транскрипции вирусного генома и подавление трансляции вирусной мРНК, что препятствует накоплению вируса в клетке-мишени.
Стойкость противовирусного иммунитета вариабельна. При ряде инфекций (ветряной оспе, паротите, кори, краснухе) иммунитет достаточно стойкий, а повторные заболевания встречаются крайне редко. Менее стойкий иммунитет развивается при инфекциях дыхательных путей (гриппе) и кишечного тракта.
Стремительные темпы развития вирусологии во второй половине XX в. позволили получить важнейшие сведения о структуре и химическом составе разных вирусов, в том числе их генома, а также о характере взаимодействия с клетками хозяев. Полученные материалы свидетельствуют о том, что вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной - вирион и внутриклеточной - вирус. Вирион наиболее простого вируса представляет собой нуклеопротеид, в состав которого входит вирусный геном, защищенный белковой оболочкой - капсидом. В то же время внутриклеточный вирус есть самореплицирующаяся форма, не способная к бинарному делению.
Тем самым в определение вируса закладывается принципиальное различие между клеточной формой микроорганизмов, размножающихся бинарным делением, и реплицирующейся формой, воспроизводящейся только из вирусной нуклеиновой кислоты. Однако качественное отличие вирусов от про- и эукариот не ограничивается только одной этой стороной, а включает ряд других:
наличие одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК);
отсутствие клеточного строения и белоксинтезирующих систем;
возможность интеграции в клеточный геном и синхронной с ним репликации.
Вместе с тем вирусы отличаются от обычных репликонов, какими являются молекулы ДНК всех микроорганизмов и любых других клеток, а также плазмид и транспозонов, поскольку упомянутые репликоны являются биомолекулами, которые нельзя отнести к живой материи.
Классификация и таксономия вирусов. Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кислоты на два подцарства - рибовирусы и дезоксирибовирусы. Подцарства делятся на семейства, которые в свою очередь подразделяются на роды. Понятие о виде вирусов пока еще четко не сформулировано, так же как и обозначение разных видов.
В качестве таксономических характеристик первостепенное значение придается типу нуклеиновой кислоты и ее молекулярно-биологическим признакам: двунитевая, однонитевая, сегментированная, несегментированная, с повторяющимися и инвертированными последовательностями и др. Однако в практической работе прежде всего используются характеристики вирусов, полученные в результате электронно-микроскопических и иммунологических исследований: морфология, структура и размеры вириона, наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида), антигены, внутриядерная или цитоп-лазматическая локализация и др. Наряду с упомянутыми признаками учитываются резистентность к температуре, рН, детергентам и т.д.
В настоящее время вирусы человека и животных включены в состав 18 семейств. Принадлежность вирусов к определенным семействам определяется типом нуклеиновой кислоты, ее структурой, а также наличием или отсутствием внешней оболочки. При определении принадлежности к семейству ретровирусов обязательно учитывается наличие обратной транскриптазы.
Морфология и структура вирионов
Размеры вирионов различных вирусов варьируют в широких пределах: от 15-18 до 300-400 нм. Они имеют разнообразную форму: палочковидную, нитевидную, сферическую форму параллелепипеда, сперматозоидную (рис. 5.1). Структура простого вириона - нуклеокапсида - свидетельствует о том, что вирусная нуклеиновая кислота - ДНК или РНК - надежно защищена белковой оболочкой - капсидом. Последний имеет строго упорядоченную структуру, в основе которой лежат принципы спиральной или кубической симметрии. Капсиды палочковидных и нитевидных вирионов состоят из структурных субъединиц, уложенных в виде спирали вокруг оси. При таком расположении субъединиц образуется полый канал, внутри которого компактно уложена молекула вирусной нуклеиновой кислоты. Ее длина может во много раз превышать длину палочковидного вириона. Например, длина вируса табачной мозаики (ВТМ) 300 нм, а его РНК достигает величины 4000 нм, или 4 мкм. При этом РНК настолько связана с капсидом, что ее нельзя освободить, не повредив последний. Подобные капсиды встречаются у некоторых бактериальных вирусов и у вирусов человека (например, вируса гриппа).
Сферическая структура вирионов определяется капсидом, построенном по принципам кубической симметрии, в основе которой лежит фигура икосаэдра - двадцатигранника. Капсид состоит из асимметричных субъединиц (полипептидных молекул), которые объединены в морфологические субъединицы - капсомеры. Один капсомер содержит 2, 3 или 5 субъединиц, расположенных по соответствующим осям симметрии икосаэдра. В зависимости от типа перегруппировки и числа субъединиц число капсомеров будет равным 30, 20 или 12. На рис. 5.1 представлены возможные типы простых вирионов, состоящих из определенного количества капсомеров, изображенных в виде шариков, а также капсомеров увеличивающегося объема.
Вирионы со сложным капсидом, построенным более чем из 60 структурных субъединиц, содержат группы из 5 субъединиц - пен-тамеры, или из 6 субъединиц - гексамеры. Нуклеокапсид сложноорганизованных вирионов, называемый «сердцевиной», покрыт внешней оболочкой - суперкапсидом.
Химический состав вирионов
В состав простых вирионов входит один тип нуклеиновой кислоты - РНК или ДНК - и белки. У сложных вирионов в составе внешней оболочки содержатся липиды и полисахариды, первые получают из клеток хозяина, вторые в виде гликопротеидов закодированы в геноме вируса.
Вирусные ДНК. Молекулярная масса ДНК разных вирусов колеблется в широких пределах (1 * 106- 1 * 108). Она примерно в 10-100 раз меньше молекулярной массы ДНК бактерий. В геноме вирусов содержится до нескольких сотен генов. По своей структуре вирусные ДНК характеризуются рядом особенностей, что дает возможность подразделить их на несколько типов. К ним относятся двунитевые и однонитевые ДНК, которые могут иметь линейную или кольцевую форму.
Хотя в каждой нити ДНК нуклеотидные последовательности встречаются однократно, на ее концах имеются прямые или инвертированные (повернутые на 180°) повторы. Они представлены теми же нуклеотидами, которые располагаются в начальном участке ДНК. Нуклеотидные повторы, присущие как однонитевым, так и двунитевым вирусным ДНК, являются своеобразными маркерами, позволяющими отличить вирусную ДНК от клеточной. Функциональное значение этих повторов состоит в способности замыкаться в кольцо. В этой форме она реплицируется, транскрибируется, приобретает устойчивость к эндонуклеазам и может встраиваться в клеточный геном.
Вирусная РНК. У РНК-содержащих вирусов генетическая информация закодирована в РНК таким же кодом, как в ДНК всех других вирусов и клеточных организмов. Вирусные РНК по своему химическому составу не отличаются от РНК клеточного происхождения, но характеризуются разной структурой. Наряду с типичной однони-тевой РНК у ряда вирусов имеется двунитевая РНК. При этом она может быть линейной и кольцевой. В составе однонитевых РНК имеются спиральные участки типа двойной спирали ДНК, образующиеся вследствие спаривания комплементарных азотистых оснований. Однонитевые РНК в зависимости от выполняемых ими функций разделяют на две группы.